Скільки разів мама забороняла вам підбирати на вулицях всякі цікаві штуковини і відправляла мити руки перед обідом? Напевно багато. Але ще частіше ви не слухалися - підбирали, що не мили і ... нічого надто страшного з вами не відбувалося. Невже мікроби існують в одному вимірі з лелекою, що приносить дітей, і Дідом Морозом? На жаль ні.
Бактерії, віруси і грибки чекають свого шансу, зачаївшись на вашій шкірі, поручнях в метро, кнопках мобільного телефону. Палець в рот не клади - ні їм, ні собі. Але ми можемо дозволити собі забути про цей зоопарк завдяки налагодженій роботі імунної системи. Одна з ліній оборони - фермент лізоцим, обов'язковий компонент сліз, слини, слизових оболонок носа, кишечника, легень. Такий собі рів на шляху одноклітинних варварів, які намагаються проникнути в наш організм. Як він працює, чому працює і як зробити так, щоб він запрацював ще краще?
Сльози за три пенси (відкриття лізоциму)
Так вже вийшло, що майже будь-яке значне відкриття в науці супроводжувалося випадковістю - у всякому разі, в очах людини посторонньої. Кожен школяр знає, що Архімед зобов'язаний своїм відкриттям ванні, Ньютон - яблуку, Менделєєв - так і зовсім здоровому і міцному сну. Із цього погляду відкриття лізоциму належить до найбільш що не є значних.
У 1922 році мікробіолог Олександер Флемінг, засіваючи чашку Петрі, чхнув. В цьому не було нічого страшного чи поганого: люди іноді чхають, і мікробіологи - не виняток. Чашку слід вимити, а дослід повторити. Акуратніші колеги шотландця так би й зробили. Але Флемінг каже: «Як цікаво!», Закриває чашку і залишає її разом з іншими. І через деякий час бачить таку картину: бактерії, які він встиг посіяти, виросли і утворили суцільний шар колоній на агарі - в мікробіології це називають газоном. Але газон цей не суцільний, і з окремими чистими ділянками, на яких чомусь ніхто не вижив. Флемінг здогадався: «залисини» залишив слиз, який покинув його власний ніс в результаті несвоєчасного чиха. Значить, в слизу є якась речовина, що вбиває бактерії?
Флемінг проводить серію дослідів. Необхідно джерело цієї речовини, досить чисте і зручне для праці. Флемінг швидко знаходить відповідне - це слізна рідина. Співробітникам лабораторії довелося поплакати як слід. У хід зазвичай йшли лимони: з них зрізали цедру і вичавлювали її в око, при цьому піпеткою з заокругленим кінчиком збирали сльози і поміщали з таким трудом здобутий матеріал в пробірку. «Півкубика» зліз з людини - відмінний результат, але цього все одно мало. Як то кажуть, кіт наплакав. За три пенси плакали в ім'я науки технічні службовці та навіть цікаві відвідувачі.
Діюча речовина назвали лизоцимом «Lysis» - лізис, руйнування; закінчення «цим» - данина ферментативній природі речовини. Також з'ясували, що лізоцим діє не на всі бактерії, а переважно на непатогенні. Причому найбільш чутливими до лізоциму виявилися жовті коки - ті самі, на які чхнув Флемінг. Шотландець зробив висновок, що лізоцим - природний захист організму від проникнення бактерій, і така ідея була для свого часу досить революційною. Сам И.И.Мечніков (між іншим, лауреат Нобелівської премії з фізіології і медицині за праці з імунітету) стверджував, що природа не вживає антисептиків, а бактерії з поверхні видаляються при механічному злущуванню епітелію. Але Флемінг знаходить антимікробну активність і в шматочку нігтя, і в зіоскобі тканини, і в волосі.
Досліди приголомшливо прості і наочні: досить помістити шматочок нігтя в пробірку з мікробною суспензією - і вона світлішає, а вмістні в ній мікроорганізми розчиняються. Його співробітники виявляють лізоцим у молоці, в ікрі щуки, в слизу дощового черв'яка, в стеблах і листках садових рослин, в ріпі. Флемінг намагається відповісти на важливе практичне питання: чи можна вбити хвороботворні мікроорганізми, подіяв на них підвищеною концентрацією лізоциму?
Кажуть, знаряд двічі в одну воронку не потрапляє. У випадку з Флемінгом явно попалися браковані знаряди: в 1928 році одна з його чашок знову постраждала через недбалість. Цього разу на ній виросла цвіль. І знову ж таки - нічого незвичайного, неминуча помарка у важкій роботі, хіба мало цієї цвілі виростало у мікробіологів всіх часів. Але шотландець знову говорить: «Як цікаво!» І уважно вивчає чашку.
На кордоні з цвіллю - чиста зона, всі бактерії загинули. Флемінг пересаджує ставшою дорогоцінною цвіль і починає досліди з нею. Це, як ви здогадалися, момент народження пеніциліну та антибіотиків. Що в цьому випадку зіграло головну роль - везіння Флемінга, якому попалася незвичайна цвіль, або його уважність і нестандартне мислення? Питання риторичне. Однак отримана речовина вбивала не тільки тривіальні бактерії, як лізоцим, а й збудників хвороб. Результат усім відомий - антибіотики врятували (і ще врятують) десятки мільйонів життів, а лізоцим відійшов у тінь. Дійсно, чи потрібен він комусь, поки є такі чудові антибіотики?
«Вбивайте всіх! Господь впізнає своїх!» - дія антибіотиків
Якщо вірити німецькому ченцеві-письменнику Цезарію Гестербахському, саме цією фразою папський легат Арнольд-Альмарік відповів на питання, як розпізнати єретиків серед католиків? Принцип дії багатьох антибіотиків, навіть сучасних, мало чим відрізняється від цього класичного формулювання: в результаті їх дії страждають як бактерії, так і організм-господар.
Наприклад, тетрациклін або пуромицин перериває синтез білка на рибосомах - на щастя, в основному на бактеріальних. Саркоміцін порушує синтез пуринів і піримідинів, без яких не будується ДНК жодної живої істоти. Виграш досягається за рахунок того, що для крихітних бактерій з коротким життєвим циклом дефіцит тієї чи іншої речовини смертельний, а щодо довгоживучих клітини макроорганізму подібний розклад переживуть, хоча добре їм від цього теж не буде.
Деякі антибіотики дають і зовсім неприємні наслідки - наприклад, вражають кістковий мозок або слуховий нерв, викликаючи зниження слуху. Є, звичайно, і антибіотики зі специфічною антибактеріальною або антигрибковою дією - той же пеніцилін, руйнує зв'язку між полісахаридними ланцюжками бактерій. Але мікроорганізми швидко набувають до них стійкість, змушуючи хіміків викручуватись і змінювати молекули антибіотика до їх повного невпізнання. Подібна гонка озброєнь змушує медиків бути весь час насторожі, шукати і відчувати все нові антибіотики і ховати їх в рукаві на випадок появи особливо стійких збудників. Вельми нервова ситуація.
Крім того, далеко не кожна бактерія в людському організмі - ворог. Найяскравіший приклад - симбіотична мікрофлора кишечника, про важливість якої нам невтомно твердить реклама. Але навіть ті мікроорганізми, які просто живуть з нами на території одного тіла, корисні вже тим, що не дають вторгатися стороннім мікробам. Так що антибіотики, знищуючи все підряд, позбавляють нас і важливого союзника в боротьбі з потенційними збудниками.
Причина стійкості бактерій до лізоциму
У старому анекдоті Штірліца, що йде по нічному Берліну, видавали будьонівка і що волочиться парашут. Бактерії, потрапивши в наш організм, теж не здатні приховати свою оболонку. Її найважливіший компонент - муреїн, він же пептидогликан. Муреин складається з вуглеводного ланцюжка і пептидного «хвоста», за амінокислотним складом якого можна визначити систематичну приналежність бактерії. Лізоцим не чіпає пептид, зате успішно розриває зв'язок між N-ацетилглюкозамінною і N-ацетилмурамовою кислотою. Оболонка бактерії може містити кілька шарів муреїну. Лізоцим розрізає їх шар за шаром, оголюючи цитоплазматичну мембрану, яка складається з подвійного ліпідного шару. Там вже за справу беруться інші літичні ферменти, і непроханому гостю приходить кінець.
Пептидогликан є в оболонці всіх бактерій, а в наших клітинах його немає. Причому ймовірність того, що будь-яка мутація зробить бактерії стійким до лізоциму, практично дорівнює нулю: наявність пептидоглікану - занадто фундаментальна ознака, щоб від нього можна було легко відмовитися. Хоча, наприклад, деякі умовно-патогенні бактерії здатні виділяти антилізоцимний фактор - біологія, на відміну від фізики, страшенно не любить всього абсолютного.
Але головна причина стійкості багатьох бактерій до лізоциму в іншому. Частина з них має порівняно товсту, близько 80 нанометрів, оболонку з муреїну, місцями пронизаного тейхоєвими кислотами. Маса такого пептидогліканового мішка може доходити до 80% від всієї маси бактерії. Ця оболонка непогано захищає від фізичних і хімічних впливів, але для лізоциму розкрити її не складає особливих труднощів. Друга група бактерій обзавелася куди менш товстою муреїновою шубою (всього 8 нм, це один - три шари пептидоглікана), зате зверху її захищає третій шар - ще одна ліпідна мембрана. Ліпідна мембрана неполярна, лізоцим - полярний, тому проникнути всередину і дістатися до полисахаридного мішка йому важко.
Бактерій першої групи мікробіологи називають грампозитивними, другий - грамнегативними. Ніякого відношення до їх масам це не має, просто ці дві групи можна розрізнити за допомогою анілінових барвників, зафіксованих йодом. Це і є фарбування по Граму. Якщо після нього етанол знебарвлює клітку - її відносять до грамнегативних, в іншому випадку - до грампозитивних. Припускають, така різниця якраз пов'язано з різною будовою оболонок.
Оскільки більшість патогенних бактерій грамнегативні, лізоцим проти них практично безсилий. Точніше, слід було б сказати навпаки: саме ті, хто навчився протистояти лізоциму, і становлять небезпеку для людини. Тим же, хто перед ним спасував, залишалося шукати менш ризиковані екологічні ніші.
Отримання та використання лізоциму
Пам'ятайте вірші Леоніда Філатова?
Захворіла - не біда!
З'їси жабу зі ставка!
Нема краще медицини,
Ніж природне зсередини!
Їсти жаб в терапевтичних цілях, мабуть, не варто. Хоча, як читачі, напевно, здогадалися, жабі без лізоциму теж нікуди. Слиз, що захищає її від висихання, містить чимало цього ферменту. Досить, щоб, скажімо, вміщена в глечик з молоком жаба запобігла скисанню. Кажуть, цей метод був дуже популярний до винаходу холодильників. Сучасна харчова промисловість, однак, використовує лізоцим окремо від жаб.
У списку харчових добавок лізоцим має індекс Е1105. Зустріти це позначення не так просто: область застосування лізоциму не дуже широка. Головним чином це виробництво твердих сирів. Іноді в них відбувається небажане бродіння, технологи називають його «спученням». Щоб цього уникнути, додають або нітрати, які потім переходять в нітрити і гальмують розвиток мікрофлори, або лізоцим. До нітратів у споживача ставлення досить насторожене, тому років з 70-х все частіше віддають перевагу лізоциму.
В принципі лізоцим можна було б застосовувати і в технології переробки м'яса, і при виготовленні продуктів з риби. Заважають цьому відносно висока ціна і не дуже висока стійкість - все-таки фермент, великі концентрації солі і температура вище 60 градусів його інактивують. Тому в якості консервантів зазвичай використовують органічні кислоти, дешеві і цілком надійні.
У медицині, де питання ціни компонентів стоїть не так гостро, лізоцим досить популярний - в складі ополіскувачів для рота, антибактеріальних мазів і пробіотиків. Застосовують його і при лікуванні очних хвороб, наприклад кон'юнктивіту.
Отримувати лізоцим можна з декількох джерел, але традиційний - куряче яйце. У ньому лізоциму багато, близько 3% від сухої маси, і навіть в розведенні 1:60 000 000 яєчний білок зберігає здатність розчиняти деякі мікроби. Якби не такі ударні дози ферменту, бактерії з задоволенням селилися б у смачному і живильному яйці, адже шкаралупа для них не дуже серйозна перешкода. Лізоцим можна виділити, осаджуючи його за допомогою звичайної кухонної солі. Але процес цей досить довгий, а вихід ферменту невисокий. Сучасна технологія - використання іонообмінних смол: цей метод зараз застосовують в Бельгії, Франції, Фінляндії, Японії.
Лізоцим курячого яйця - один з найбільш вивчених ферментів. Це досить невеликий білок: 129 амінокислотних залишків і молекулярна маса близько 14 000 дальтон. Він став першим ферментом, чию тривимірну структуру вивчили за допомогою рентгеноструктурного аналізу, сталося це ще в 1965 році. Виявилося, що лізоцим - дуже зручний лабораторний об'єкт.
Яйце - не єдине можливе джерело лізоциму. Наприклад, його цілком успішно синтезують бактерії для боротьби зі своїми родичами. І не тільки його, а й інші позаклітинні литичні ферменти. Це не тільки дозволяє тримати сусідів на відстані, але і забезпечує клітці додаткові поживні речовини. Причому лізоцим бактеріальний - не те ж саме, що лізоцим курячого яйця. А лізоцим яйця - не те саме, що лізоцим молока.
І взагалі, різновидів лізоциму може бути дуже багато. Пов'язано це з тим, що лізоцим - фермент, тобто білок, і тому складається з амінокислот, послідовність яких записана в генетичному коді. Найважливіша його характеристика - субстрат, тобто речовина, на яку діє фермент. Так ось, всі лізоцими атакують один і той же зв'язок в одній і тій же речовині - пептидоглікані. При цьому вони можуть бути зроблені з різної кількості амінокислот і, отже, по-різному виглядати в просторі. Звідси береться безліч вторинних ознак - різна молекулярна маса (зазвичай від 13 до 23 тисяч дальтон), різна активність в тих чи інших умовах, різні продукти розщеплення. Якщо згадати, що і пептидоглікани відрізняються за складом пептидних хвостів, і не забувати про іншяі елементи оболонок - виходить складна картина, в якій не так просто розібратися. Але бактерії (і не тільки бактерії) якось примудряються це робити і синтезують саме ті варіанти ферменту, які мінімально впливають на них самих і максимально - на конкурентів.
Ворог мого ворога в середовищі мікробів
Знаючи, з яким задоволенням представники мікросвіту труять і зживают один одного зі світу, логічно припустити, що на кожну шкідливу для нас бактерію можна спробувати нацькувати її природного ворога. Підхід тим більше привабливий, що існують дуже зручні кандидати на роль ворогів - бактеріофаги. Це віруси, дуже схожі на ті, від яких страждаємо ми, але вражають вони тільки бактерій. Спроби використовувати фаги в медицині відносяться ще до 1920-х років, а в 1930 - 1932-ті їх застосовували для боротьби з епідемією холери в Індії.
Головна їхня перевага - дуже висока специфічність: фаг кріпиться до певного білку на зовнішній оболонці бактерії і лише після цього впорскує всередину свою генетичну інформацію. Кількість фагів стрімко наростає з кожною новою жертвою, вони не впливають на нормальну мікрофлору і можуть працювати спільно зі звичайними антибіотиками. Але специфічність обертається недоліками, через які фагова терапія так і не вийшла на перший план. Кожен тип вірусу націлений на один-єдиний штам бактерій, невелика мутація в білку-рецепторі жертви - і фаг безсилий. А наслідки мутації в самому фагові можуть бути непередбачуваними. Тому кожен фаг потрібно довго і ретельно вивчати, перш ніж вводити в організм людини, а діяти він в результаті буде лише на один штам збудника.
Втім, можна піти трохи далі. Фаг - не дуже складна біологічна машина: кількість білків, що кодуються його нуклеїновими кислотами, набагато менше, ніж у будь-якого іншого організму. І завдання фага просте і невибагливе: знайти жертву, проникнути, розмножитися і чекати наступної.
Для нас найбільш цікавим є те, як фаг проникає в клітину. Саме на цьому етапі він задіює свій лізоцим, а також ряд схожих літичних ферментів. Якби не вони, фаг, навіть закріпившись на поверхні, не зміг би пробитися крізь шар пептидоглікану. Можна розмножити велику кількість фага, виділити з нього ферменти і використовувати їх як засіб від бактерій. Але це важко - фаги дуже маленькі, і відокремити їх від ферментів не так просто. Та й культивувати самі фаги складніше, ніж традиційні для біотехнології бактерії або дріжджі.
Як завжди в складних випадках, на допомогу приходить генна інженерія. Можна виділити з фага ген, який відповідає за синтез лізоциму, і вбудувати його в більш зручний для вирощування організм. Бактерії підходять погано, адже накопичений лізоцим буде придушувати їх розвиток. А ось дріжджі - гарний варіант. Муреїна в них немає, тому лізоцим їм не перешкода. Щоб рекомбінантний лізоцим міг проникати крізь зовнішню неполярну мембрану грамнегативних бактерій, до нього «пришивають» гідрофобний пептид довжиною до п'яти амінокислот. Причому такий же підхід застосуємо і до інших літичних ферментів, схожих за дією на лізоцим - наприклад, руйнуючого сусідні зв'язки в тому ж пептидоглікані. В англомовній літературі їх всіх об'єднують словом «lysins». Але в нашій мові це слово прижилося погано, тому що занадто нагадує назву амінокислоти лізин. Так що у нас їх теж називають лізоцинами - по найбільш відомому ферменту цього класу. Ще один варіант назви, який можна зустріти в літературі, - ензібіотики, тобто білкові антибіотики.
Описана технологія реалізована сьогодні для деяких збудників. Наприклад, за кордоном успішно працюють з фагами синьогнійної палички та підбирають засіб проти золотистого стафілокока і лостридій. До лікарень подібні нововведення ще не встигли дійти, але головне, що ланцюжок «бактерія - фаг - препарат з рекомбінантних літичних ферментів фага» працює. Це дозволяє сподіватися, що до будь-якого збудника можна буде підібрати найбільш згубний для нього лізоцим. І тоді лікарі навчаться пригнічувати навіть ті штами бактерій, які вже встигли придбати стійкість до антибіотиків. При цьому специфічність дії препарату буде така, що непатогенні мікроорганізми не загинуть, але всі штами збудника потраплять під удар.
Можна провести таку аналогію: звичайний антибіотик - це відмичка, що відкриває всі замки, але незручна в повсякденному житті і може зіпсувати замок. Тоді двері вже ніяк не відкрити. Фермент, який грає роль антибіотика, - ключ до замка, відкриває тільки його, але може працювати без нарікань багато років. Правда, ключів потрібна дуже велика зв'язка. Щоб замінити відмички ключами, залишилося всього нічого: перебрати 1031 бактеріофагів (саме такою цифрою оцінюється їх кількість на планеті) і вибрати ті, які зможуть пригнічувати ту чи іншу інфекцію. Гарне, благородне завдання на найближчі роки.
